Как выбирают условия фотометрирования, если определяемое соединение и используемый реактив имеют окраску, отличную друг от друга, и реактив присутствует в избытке

Фотометрировать в таком случае нужно при длине волны, при которой разница в поглощениях обеими окрашенными формами максимальна. Для этого необходимо. Определение области (или длины волны) максимального (оптимального) поглощения света раствором исследуемого соединения.

В диапазоне длин волн 210–750 нм или 360–750 нм с помощью спектрофотометров снимают спектры поглощения растворов определяемого компонента с реагентом при соотношениях , равных 1, 10 и 0,1 при различных значениях рН, несколько превышающих рКа фотометрического реагента. Оптическую плотность растворов измеряют относительно раствора реагента или чистого растворителя: в последнем случае снимают спектр и раствора реагента. По спектрам поглощения растворов находят длину волны или участок спектра, где наблюдается максимальное значение оптической плотности Амакс (или разности оптических в случае светопоглощающего реагента). Все последующие измерения оптической плотности растворов производят при найденном значении длины волны максимального (оптимального) светопоглощения.

Количественный выход светопоглощающего соединения может гарантироваться лишь в присутствии достаточного избытка реагента, который обычно превосходит в 2–5 раз оптимальный избыток для верхнего предела градуировочной кривой. Необходимый избыток реагента зависит от относительной устойчивости фотометрируемого комплекса и мешающего влияния сопутствующих компонентов. Его рассчитывают теоретически или определяют экспериментально в предварительных опытах. Если раствор реагента сам поглощает свет в условиях фотометрирования, то значительный избыток реагента крайне нежелателен из-за высокой оптической плотности раствора холостой пробы. Поскольку вид разностного спектра зависит от концентрации каждого компонента, желательно снимать его в условиях (концентрациях), приближенных к реальным, снимая (если только это возможно) спектры каждой окрашенной формы, а затем вычитая одну из другой.